高考引物设计_引物设计hairpin

1.高中生物怎么确定引物在哪

2.怎样设计PCR引物

问题一：PCR扩增时为什么需要引物呢? 因为DNA聚合时需要3‘OH，这个只能由引物提供（没原因，就因为是那样）。这个引攻是一小段RNA ，引物绝对是RNA，而不是DNA。看看DNA复制需要什么酶就知道了，需要依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP）如果是DNA，那么复制的时候要引物干什么呢？我直接用互补脱氧核糖核酸就完了，干嘛还弄一引物，然后复制完再水解掉？本人生化学的还是不错的，别人都说难，我也不觉得。

问题二：怎么设计引物？ 5分 选择引物的一般规则

设计和选择引物时有5个要素必需注意。

1 引物的3′末端不互补 引物的3′末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。有实验表明，3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%，到－8时少于20%，而－10时，接近于0。虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用Taq聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在很短的时间内就识别3′末端互补的双链区并发动聚合反应，即使3′末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对二聚体的形成就有很大的依赖性。

2 引物分子内不互补 应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷酸。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。

3 引物的组分、解链温度和长度 普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。其实，这是不对的。以人基因组DNA为模板，用81% AT的引物可以产生单一的，专一的，长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长，而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的产物。但是，引物较长时，如果不借助引物选择的计算机软件帮助，就很难确定一对引物是否会形成二聚体，是否有自身互补性以及专一性如何。于是，用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA时就会使引物彼此引发而不是延伸模板，得出非专一产物。

4 引物的内部稳定性 在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。还要注意的是PCR反应产的质量还取决于模板(底物的复杂性、Tm、产物长度)和退火的温度与时间。所以，有时3′末端稳定的引物也可以满意地进行反应。但是，无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal......>>

问题三：设计引物之前为啥要进行同源性比较？ 引物种类多了，看你设计哪种引物了。

如果你想在基因组或者cDNA上P一个基因，这个基因在物种上是一个家族，你肯定就要和本物种内其他家族成员进行比较，避开保守区，以免设计的引物P到那些基因。

你要是想尽可能地P整个家族的基因，同样你也得比较，找到它们共同的保守结构，在这上面设计引物。

也不是每种引物设计都要比对同源性。

还有很多情况，不能一概而论。你可以把你具体的情况补充说明一下。

问题四：为什么设计PCR引物时，后面那条引物设计出来后要反转？ 两条引物针对两条链设计，因为扩增的方向都是5‘-3’。每条引物针对一条链，这样整个PCR反应就两条链都合成出来了。所以设计的时候，第二条引物是用互补链为模板设计的，所以要反转。

用引物设计软件设计，很容易就搞清楚原理了，也不容易出错。

问题五：为什么设计引物G+C百分含量上下游引物要小于5 为什么设计引物G+C百分含量上下游引物要小于5

1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

2.产物不能形成二级结构。

3. 引物长度一般在15~30碱基之间。

4. G+C含量在40%~60%之间。

5. 碱基要随机分布。

6. 引物自身不能有连续4个碱基的互补。

7. 引物之间不能有连续4个碱基的互补。

8. 引物5′端可以修饰。

9. 引物3′端不可修饰。

10. 引物3′端要避开密码子的第3位。

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2.在框中粘贴入你的原始序列(要比你要扩的目的片段两端延伸一点)

3.在框的下方有许多可以设定的限制条件,如片段长度,一定包含的片段位置,引物长度,引物退火温度等,你可以进行设定

4.点击"pickup primers"就会出现下一页,上面会列出多种设计,一般来说,第一对引物是最适合的.

同时引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：

(1) 引物长度约为16-30bp,太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高.太长则比较浪费,且难以合成.

(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).

(3) 四种碱基应随机分布,在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发.

(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对.

(5) 在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构.

两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量.两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性.

(7) 引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基.

引物不与模板结合位点以外的序列互补.所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量.

(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3'端应不存在简并性.否则可能由于产量低而看不见扩增产物.

怎样设计PCR引物

聚合酶链式反应中的引物长度：15-30碱基对，常用为20碱基对左右。

聚合酶链式反应中有两条引物，即5’端引物和3’引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5’端引物与位于待扩增片段5’端上的一小段DNA序列相同；3’端引物与位于待扩增片段3’端的一小段DNA序列互补。

引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。

设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理：

① 引物长度

一般引物长度为18~30碱基。总的说来，决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以用于粗略计算引物的退火温度。

在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54℃的最短的引物可获得最好的效率和特异性。

引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。

② GC含量

一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

③ 退火温度

退火温度需要比解链温度低5℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火

温度是一样的，可以在55℃～75℃间变化。

④ 避免扩增模板的二级结构区域

选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2’-脱氧GTP取代dGTP对扩增

的成功是有帮助的。

⑤ 与靶DNA的错配

当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这个时候有必要先使用BLAST软件进行检测，网址：。